Diseño de fármacos antivirales usando modelos de supercomputacion y docking.

Estimad@ autor@: Es un placer comunicarle que el trabajo de su autoría: "Diseño de medicamentos anti COVID19 in silicio (Mpro)" ha sido publicado e incluído en el último número de la Revista Electrónica de PortalesMedicos.com:

Diseño de medicamentos anti COVID19 in silicio (Mpro) Autor principal: Juan Carlos López Corbalán Vol. XVI; nº 8; 452 Designing Drugs targeting Mpro of SARs-CoV2 in silicio Fecha de recepción: 03/02/2021 Fecha de aceptación: 19/04/2021 Incluido en Revista Electrónica de PortalesMedicos.com Volumen XVI. Número 8 – Segunda quincena de Abril de 2021 – Página inicial: Vol. XVI; nº 8; 452 Autores: Juan Carlos López Corbalán, José Miguel Seguí Ripoll. Administración general del estado; Hospital San Juan de Alicante. Alicante, España. Resumen: En la actualidad la pandemia de la beta coronavirus SARS-CoV2 ha causado más de 2,2 millones de muertos y 120 millones de infectados, y las cifras quedarán obsoletas en pocos minutos, porque están muriendo entre 19.000 y 26.000 personas al día en el planeta. De momento no hay un tratamiento antiviral efectivo contra esta plaga. Creemos que el diseño de fármacos por súper computación podría ser una útil herramienta para encontrar ése antiviral barato, efectivo, por vía oral y sin reacciones adversas. Se estudian los fármacos que actúan sobre la proteasa Mpro del SARS-CoV-2 y los que actúan sobre la RNA dependiente RNA polimerasa dependiente de RNA. “RdRp” Palabras clave: COVID-19, in silicio, medicamentos, antivirales, diseño Abstract:

Currently the pandemic of the beta coronavirus SARS-CoV2 has caused more than 2.2 million deaths and 120 million infected, and among 19,000 and 26,000 people are dead every day. At the moment there is no effective antiviral treatment against this disease. We believe that the docking of drugs by supercomputation could be a useful tool to find that antivirals. Drugs that act on the SARS-CoV-2 protease Mpro and those that act on RNA-dependent RNA polymerase are reviewed in this paper. Keywords: COVID-19, in silicio, drugs, antivirals, design, RdRp, Mpro. Los autores de este manuscrito declaran que: Todos ellos han participado en su elaboración y no tienen conflictos de intereses. La investigación se ha realizado siguiendo las Pautas éticas internacionales para la investigación relacionada con la salud con seres humanos elaboradas por el Consejo de Organizaciones Internacionales de las Ciencias Médicas (CIOMS) en colaboración con la Organización Mundial de la Salud (OMS) https://cioms.ch/publications/product/pautas-eticas-internacionales-para-la-investigacion-relacionada-con-la-salud-con-seres-humanos/ INTRODUCCION. A día de hoy no hay un antiviral eficaz para tratar la COVID19. El único fármaco que ha logrado disminuir la mortalidad (de forma estadísticamente significativa) es la Dexametasona, que no es propiamente un fármaco antiviral, sino un corticoide inhibidor de las reacciones antiinflamatorias. La pandemia actual de COVID-19 cuyo agente etiológico es el SARS-CoV-2 es responsable de la emergencia sanitaria mundial. Hay un principio básico en Virología que siguen TODOS los virus de la clasificación de Baltimore (que es el nombre del Científico David Baltimore) Premio Nobel Medicina, 1977) que la realizó. Ese axioma fundamental dice: Todos los virus del planeta siguen la regla de que para generar sus genomas tienen que hacer RNA mensajero y ser leído por los ribosomas del huésped. TODOS.

Fig.1 Axioma de la Virología. Por lo tanto, los fármacos antivirales podrán tener diferentes “targets”, pero todos al final pasan por esas horcas caudinas de tener que traducir su m RNA en proteínas o material genómico usando las organelas, ribosomas y enzimas del huésped a quien infectan. Actualmente, no existe un remedio específico disponible contra el SARS-CoV-2. En consecuencia, es fundamental desarrollar un antiviral efectivo, barato, de administración oral, de buena biodisponibilidad, de toxicidad selectiva y además barato. Hay 28 proteínas sobre la superficie del virus, pero las 4 más conocidas son: La proteína S (espiga), la N (nucleocápside), la M (de membrana) y la E (Envoltura). En la actualidad casi todo el esfuerzo de focaliza sobre los 1274 aminoácidos de la proteína S o espícula. Al ser grandes estructuras, podemos visualizarlas por técnicas de Crio EM y VR y buscar esos residuos hidrofóbicos formados por aminoácidos aromáticos (“pockets”) donde podrían encontrarse receptores para moléculas de peso molecular de entre 350 y 900. Las dianas terapéuticas más adecuadas las buscaremos apoyándonos en la supercomputación y el docking y cribaje de nuevas moléculas o reposicionamiento de otros fármacos ya aceptados y autorizados para tratar otras patologías y orientarlo para atacar las dianas terapéuticas del SARS-CoV-2 (12). ¿Son útiles los diseños de fármacos por ordenador? Pues sí. Los súper ordenadores no diseñan nada, no crean nada si no están bien programados para ello, pero son muy útiles como herramienta accesoria y ponemos dos ejemplos. Fig. 2 El Zanamavir (Relenza ®), diseñado con métodos computacionales contra el receptor siálico del ortomixovirus. O el Indinavir, Crixivan ®, dirigido hacía la proteasa del retrovirus HIV. Son dos ejemplos válidos para sustentar que se pueden diseñar fármacos antivirales con la ayuda de las técnicas de docking, cribado y uso de supercomputación para el screening “in silicio” de nuevos fármacos anti virales. Innecesario decir que no se ha encontrado hasta el momento ningún fármaco antiviral contra el SARS-CoV2 (2). No es fácil. Y la historia nos demuestra que algunos antivirales se descubrieron i por serendipia, como la Amantadina, que mejoró los síntomas gripales de un grupo de enfermos a los que se trataba buscando antihistamínicos. O las muy conocidas de Pfizer, el Sildenafilo (Viagra) ®, originalmente se buscaba como antihipertensivo. Lo anteriormente expuesto nos obliga a reconsiderar que esta pandemia hace que cambie el paradigma y se usan las supercomputadoras y los programas de diseños y desarrollo de fármacos por métodos computacionales “in silicio”. E incluso se hace una modificación de la teoría heurística del docking y se realiza cribado selectivo sobre fármacos ya aprobados, de forma y manera tal que podamos “ganar tiempo” y podamos encontrar ésa solución farmacológica de la pandemia. Tal sería el caso del Raloxifeno, fármaco ya autorizado que ahora se demuestra que por cálculo químico farmacéutico tiene acción inhibitoria de la RNA polimerasa del SAR-CoV 2. Puntualizar que esto es una ayuda a la investigación, pero los supercomputadores no “diseñan” fármacos sólo, sino tan solo una herramienta accesoria, no son necesariamente predictivos. Y quizás lo más importante: El “docking” no demuestra que la molécula se una efectivamente al receptor. Docking o acoplamiento molecular computarizado (1) Virtual screenig o identificación y búsqueda de compuestos dentro de una colección o conjunto de similares (un a library previa) y características. Mediante hits computacionales vamos experimentando. Un ejemplo en estudios de Farmacognosia nos ponemos a identificar todos los alcaloides del cornezuelo del centeno (Claviceps purpúrea, que parasita al centeno (Secale cereale). Esto es el cribado virtual, usando supercomputación o modelo “in silico”. Incrementamos la probabilidad de encontrar moléculas activas. Pharmacophore modeling el fin es detectar el arreglo tridimensional de las características mínimas en forma de mapeo de la nube electrónica y, abajo se ilustra el modelo farmacóforo en el que se presentan las interacciones con el receptor. La esfera roja de elevada carga negativa ( -2,19) y – 11,74, aceptan puentes de hidrógeno, los anillos en azul dan y el anillo Fig.4 Farmacoforos.significa que puede tener nube electrónica pi, como el benceno En la figura 5 de abajo tenemos el ácido trimetil aurin tricarboxílico, con sus tres grupos farmacóforos marcados con un asterisco. Dianas terapéuticas para el SARS-CoV-2 La RNA polimerasa. Ejemplo: Remdesivir, o Metisazona (3), por poli farmacología: Raloxifeno. poli farmacología: tenemos ya otras moléculas aceptadas, pero con otra indicación terapéutica, con lo cual podemos usarlos para una nueva indicación sin volver a tener que realizar estudios toxicológicos. La eEF1A (Eukaryotic translation elongation factor 1 alpha), en éste caso realmente no actuamos sobre el virus, sino sobre un factor del huésped, pero lo hemos incluido igualmente. Ej.: Plitidepsina. Otro ejemplo de cribado en library. Este fármaco se usaba contra el mieloma múltiple. Ahora se le busca aplicación en Fase I contra la Covid 19. La MPro o Proteasa 3CLpro.La estructura de la Mpro la tienen en la Fig. 6 Ejemplos serían el Ebselen también llamado PZ51 DR3305, ó SPI-1005, Carfilzomib (7,8,9). Nos vamos a centrar en ésta Mpro, usando técnicas de cálculo químico farmacéutico buscando moléculas de peso molecular entre 340 y 900 que se unan a esos residuos hidrofóbicos que se forman en determinadas regiones y probar a base de “fuerza bruta” diversos fármacos que han demostrado actividad sobre Mpro son Etopósido, Hesperidina, Velpatasvir, Diosmina y Venetotoclax. Fig.7. La RnRp ó Ribonucleasa dependiente de m RNA polimerasa (4). Se descubrieron partir de estudios sobre el Mengovirus y el virus de la polimielitis cuando se observó que estos virus eran insensibles a la actinomicina D, un fármaco que inhibe la síntesis de ARN celular catalizada por ADN. Esta falta de sensibilidad sugirió que existe una enzima específica del virus una enzima propia de los virus de ARN que cataliza la replicación del ARN a partir de una plantilla de ARN. que podría copiar ARN de una plantilla de ARN y no de una plantilla de ADN. Como el MK-7376, al parecer tienen acciones como inhibidores de la proteína ácida con función endonucleasa o los dos compuestos CoViTris2020 and ChloViD2020 (5) ó el Mr224 (14) Los canales ionóforos: Ej.: Ivermectina al 0,6 %. Esta acción “in vitro se está estudiando también “in vivo” en ensayos clínicos. Los inhibidores de la proteasa alfa ceto glutarasa. Ej.: Telaprevir, Borceprevir. Estos fármacos inhiben la proteasa del virus de la Hepatitis C, en concreto su IP de serina NS3-4A del VHC, enzima esencial para la replicación del virus. Dudoso que tengan ninguna acción contra el SARS-CoV-2, aunque ambos sean virus RNA mono catenarios de la clasificación IV de Baltimore. Elevación de pH endoplásmico, inhibiendo metabolismo viral: Hidroxicloroquina. Hablar dela Cloroquina y su hidroxiderivado nos llevaría al escándalo Surgisphere y la revista The Lancet, y preferimos dejarlo de lado. La Cloroquina tiene varios mecanismos de sobre el SARS-CoV-2, impidiendo su entrada y difusión a la célula, pero el aumento del Ph intracelular es quizás el más importante. Inhibidores de la Fusión. Que inhiben los procesos de anclaje y fusión. En concreto a la proteína TMPRSS2. Aquí tendríamos el Acetato de Camustat, del cual se están haciendo ensayos clínicos. Fármacos que inhiben los procesos de anclaje y fusión. En concreto a la proteína TMPRSS2. Cuando el virus SARS-CoV2 se ancla al receptor ACE/2 h de las células epiteliales, sufre dos cleavages. 1) Uno es dependiente de furinas, una proteína existente en el propio sistema del huésped, pero que el virus, ladinamente usa contra el huésped (el hospedador, como lo llaman en los libros de Virología sudamericano), lo que hace para aprovecharse de nuestro sistema para empezar a generar virones meta estables anclarse (S1) y luego fusionarse (S2). Estos son pasos muy importantes sobre los que conviene profundizar, como haremos más adelante. 2) El segundo cleavage se produce con la S2 cambiando la conformación y aparece una proteína de fusión, absolutamente necesaria para penetrar en la célula epitelial humana que es el huésped (no se ha demostrado la posibilidad en células endoteliales, como proponían dos cirujanos torácicos americanos. Hay un cambio conformacional y pasamos de una proteína pre fusión PDB-6VSB a otra proteína de post fusión. PDB:6LXT. Aquí actúa el Mesilato de Camustat, inhibiendo la TMPRSS2 y sobre el que se están haciendo ensayos clínicos que determinen su uso en clínica. Esta proteína de fusión del virus es fundamental, junto con el de anclaje. ¿Cuándo se produce el “cleavage”? ¿En la superficie de la célula o en el endoplasma? ¿Ese proceso de cambio conformacional va influenciado por el pH? Un pH muy básico (conseguido por ejemplo tomando HCQ, subiendo el pH intracelular por encima de 8,5 inhibirían los procesos endonucleares del virus, produciendo su enlentecimiento reproductivo e inhibe el proceso El “cleavage” (anglicismo para definir rotura enzimática) de S1 y S2 se realiza por la llamada a proteína de corte de furinas. Si, las mismas proteínas de corte de furinas que, según la disidente china son una de las tres características del virus propias de haberse sintetizado en un laboratorio, a partir de dos virus corona del resfriado vulgar y luego una insertación de la espícula por técnicas que habrían llevado unos seis meses. Eso explicaría también las notables diferencias entre las tres proteínas de la espiga de murciélago de herradura, pangolín ( Manus javanica) y SARS-CoV 2. 9. Mecanismo poco conocido. Inducción de errores por parte de la proof reading del virus, posiblemente por ser análogo de citosina. En éste cajón de sastre tendríamos al MK 4284 o Molnupiravir. 10. Otros. Aclarubicin, TMC-310911 y Faldaprevir (13), posibles inhibidores de Mpro. NO hemos incluido en ésta revisión los siguientes grupos: 1 Los anticuerpos monoclonales, porque su mecanismo de acción va ligado a los epítopos o determinantes antigénicos. Dejamos fuera al Lyco 5555 ®, el Regeneron ® ó el anticuerpo monoclonal ya “clásico” contra el SARS-CoV-1, el CR 3022 S. 2 los inhibidores de Il6: Tocilizumab y Siltuximab. Porque no son fármacos específicos para la COVID19, ya se usaban para otras patologías y ya estaban aprobados y no hay que volver a hacer estudios de toxicidad crónica y agua, pues ya están en su Ficha Técnica. Por la misma razón, dejamos fuera de este estudio al Sarilumab, Bariticinip , Erlitinib, y Sumatinib. 3 Los inhibidores de la IL -1. El Anakinra. Mismo motivo. 4 Inhibidores JAK 1 y JAK 2: Ruxolitinib 5 El plasma humano de enfermos convalecientes, porque hay dudas sobre su efectividad y además aumentan los accidentes trombóticos dada la elevada reología del plasma de convalecientes.

MATERIAL Y METODOS. Primeramente se hizo una búsqueda bibliográfica primaria de la información obtenida de clinicaltrials.gov que está gestionada por la National Library of Medicine (NLM) y el National Institutes of Health (NIH) de la Food and Drug Administration del Gobierno de los Estados Unidos de América. Igualmente se han utilizado los buscadores médicos y las revistas BioXriv, ChemXriv, New England Journal of medicina y JAMA. Se han excluido los artículos de The Lancet porque, después del escándalo Surgiphere, no nos merece confianza ni credibilidad la citada revista. Luego se emplearon técnicas de Vr empleando un sistema Oculus Quest 2 white, bajo licencia de Nanome Inc. soportada en un modelo de PC con microprocesador MSi Trident 3 10 SI-016EU 17-10700/16/512/GTX 1660 SA/W. Hay otros porgramas, como el Link3D o el Naive Bayes(12). Algoritmo Básico del que se dice (12) tiene una eficacia del 73% para predecir medicamentos con actividad anti SARS-CoV-2. RESULTADOS: Hay 28 proteínas en la superficie del betacoronavirus causante de la COVID19, pero nos hemos centrado en los fármacos que inhiben la proteasa M pro del coronavirus (CoV) (Mpro también llamada 3CLpro), que juega un papel indispensable en el ciclo biológico del virus. Aquí ven la serie de cinco moléculas que se unen a los residuos hidrofóbicos (“bolsillos o pockets”). En la figura de abajo ven los citados residuos hidrófobos marcados en negro. Usando técnicas de docking y su afinidad química entre sustrato y receptor expresadas kcal/ mol. Otros autores (16) han usado El llamado Glide-Schodinger dock score, así se descubrieron como inhibidores de la Mpro el Lopinavir, Amodiaquina, y el Digalato de teaflavina.

Fig. 9 Pocket 1 Energía: -8,41 kcal/mol. Fig. 10 Pocket 2. Energía: -7,77 Kcal/mol. Fig. 11 Pocket número 3 : Energía: -8,51 Kcal/mo Fig. 12 Pocket número 4.: Energía: -8,29 kcal/mol. De origen farmacognósico nos encontramos otros productos. (6) La épsilon –Viniferina ( -8,6 kcal/mol) o el Dehirdectol ( -10,3 kcal/mol), el Carnosol ( -8,2 kcal/mol) el Arjunglucoside ( -7,78 kcal/mol) y el Rosmanol (- 7,95 kcal/mol). (10) Esta revisión prevé que los inhibidores dirigidos a CoV Mpros podrían convertirse en fármacos antivirales de amplio espectro en caso de COVID-19 y otras enfermedades relacionadas con CoV (proyecto Excakate4Covid). Los resultados de la estructura cristalina y del acoplamiento han demostrado que los inhibidores de Ebselen, TDZD-8 y derivados de α-cetoamida. Fig. 13. como potenciales fármacos, ya que, en el laboratorio buscamos el concepto de Mutación letal y entrada en catástrofes de error, que podría conseguirse con la aplicación de varios de éstos compuestos en asociación, con lo que podriamos disminuir su toxicidad. La inducimos cuando nos dedicamos a ir exponiendo al virus a diversos antivirales que actúan sobre diferentes mecanismos, aumentando la tasa de error en la RNA polimerasa del virus de forma artificial hasta que se extingue el virus. Aquí podría ser una asociación de inhibidor de la proteasa, un inhibidor de la polmerasa y un inhibidor de la proteína de fusión. Otros farmacos que también tienen el mecanismo conjunto de la entrada en catástrofe de error son el Favipiravir, en estudios realizados en Japón, la Ribavirina o la Ivermectina al 0,6 % , cuyo mecanismo de acción sería bloquear los los canales ionóforos del virus. Los genomas de los viriones metaestables tienen que hacer mRNA, que tendrá que ser leído por los ribosomas del huésped para poder ser leídos por los ribosomas. CONCLUSIONES El diseño de fármacos anti COVID19 por técnicas de cribaje, acoplamiento molecular computarizado y modificación de los farmacóforos puede ser una buena herramienta terapéutica para encontrar nuevos antivirales. En la actualidad hay varios fármacos anti COVID19, especialmente inhibiendo la proteasa del virus ( 11) , pero de momento no hay tratamiento de la enfermedad. El único medicamento que ha demostrado disminuir la mortalidad de forma estadísticamente significativa es la Dexametasona, pero no es en si un fármaco antiviral, sino un modificador de la respuesta inflamatoria. Los compuestos Ivermectina al 0,6 % ( inhibidor de los canaes), la Amilorida ( proteína E), Remdesivir ( inhibidor de la RNA polimerasa) y MK 4482 son interesantes alternativas, pero ningno de ellos ha demostrado ser la panacea que todos esperamos para curar esta enfermedad. Virtual screenig o identificación y búsqueda de compuestos dentro de una colección o conjunto de similares (un a library previa) y características. Mediante hits computacionales vamos experimentando. Un ejemplo en estudios de Farmacognosia nos ponemos a identificar todos los alcaloides del cornezuelo del centeno (Claviceps purpúrea, que parasita al centeno (Secale cereale). Esto es el cribado virtual, usando supercomputación o modelo “in silico”. Incrementamos la probabilidad de encontrar moléculas activas. En cuanto al origen de la epidemia, no es el objetivo del trabajo sumergirse en esas complejidades, pero, cualquier científico que pretenda llevar a cabo una cruzada contra la hipótesis de la zoonosis basándose en que a día de hoy no se ha encontrado al paciente 0, ni conocemos al vector intermediario va por un mal camino. Ningún científico que vaya contra el dogma oficial nunca obtendrá ni fondos, ni subvenciones, ni podrá publicar nada. Y se le cerrarán todas las puertas. Y seguimos pensando que , esa teoría especulativa de la disidente china tiene un talón de Aquiles: dice que el coronavirus de murciélago R aTGa 13 que tiene un genoma idéntico al 96,1 % con el wild type que produce la COVID19 y se secuenció el 10 de Enero del 2020, no existe en la naturaleza y es un virus artificial creado por el Ejército Chino. Pero no da más detalles, no dice que fue aislado y anunciado en journals y paper en 2013 y ella se ha esperado 7 años antes de decir que es falso. No convence y parece más plausible la vía de que ésta pandemia es una zoonosis. Por una simple cuestión estadística. Hay 10 elevado a 30 virus en un mililitro de agua de mar cerca de una depuradora. Se calcula que la biomasa de todos los virus del planeta es de 10 elevado a la 48. En la fauna silvestre circulan en torno a 1,6 millones de virus distintos, y entre 631 000 y 827 000 de ellos podrían ser zoonóticos. Existen muchísimos virus que nunca han sido aislados, pero que por fuerza en próximos años podrán volver de nuevo con la misma o peor fuerza que tiene éste actual. Ahora imaginen que la próxima pandemia, en vez de tener una letalidad como la del SARs-CoV-2 baja, del 2-3 %, nos encontremos una mutación con una letalidad como el arenavirus de la fiebre Lhasa ó el de la fiebre hemorrágica Marburg. Quizás dentro de unos años sepamos más. Para la llamada “Gripe española” hubo que esperar 15 años para descubrir, analizando unas muestras de cadáveres conservados en pendregast, que en 1932 se encontró y aisló el verdadero agente de la pandemia de 1918-20- Esperemos que no tengan que pasar 15 años para saber el origen de ésta pandemia. Esperemos que las técnicas de docking nos permitan encontrar un antiviral específico contra el SARS-CoV-2, esa “bala mágica” que decía Ehrlich que tendrá que pasar, absolutamente, sobre el M RNA viral que es leído por los ribosomas 80 S de la especie humana.

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