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domingo, 3 de mayo de 2020

Mutaciones del COVID-19. Concepto de proof reading. Diseño de fármacos sobre la ExoN del COVID19.

DEDICATORIA: Para Amelia.













Filogenéticamente, antes de hablar de mutaciones, los  betacoronavirus taxonómicamente género Betacoronavirus (Coronavirus del grupo 2), se reconocen comúnmente cuatro linajes (a, b, c y d).
  • El linaje A (subgénero Embevirus ) incluye HCoV-OC43 y HCoV-HKU1 

  • El linaje B (subgénero Sarbecovirus ) incluye SARS-CoV  y SARS-CoV 2 (inicialmente 2019-nCoV)

  • El linaje C (subgénero Merbecovirus) incluye el coronavirus de murciélago Tylonycteris HKU4 
  • (BtCoV-HKU4), el coronavirus de murciélago Pipistrellus HKU5 (BtCoV-HKU5) y MERS-CoV 

  • El linaje D (subgénero Nobecovirus) incluye el coronavirus de murciélago Rousettus HKU9 (BtCoV-HKU9)​





El genoma del COVID19 se secuención el 10 de Enero del 2020, nunca entiendo porque tanto en su genoma se diga " oscila entre las 26 y 32 kilobases" y otras veces " aproximadamente 30.000 kilobases2.  En otros artículos he leído " entre 28 y 32 kbase".  

El  SARS-CoV-2 es  RNA monocatenario, y se replica en sentido  (+), en el sentido de las manecillas del reloj.
Otra cosa que  "se dice" es que  " que es de gran tamaño". Habría que afinar un poco mas: entre 80 y 140 nanómetros de diámetro. 


 La estructura general del genoma de β-CoV es similar a la de otros CoV, con una poliproteína replicasa ORF1ab ( reppp1ab ), entre otros elementos. Esta poliproteína se escinde en muchas proteínas no estructurales.







La teoría evolutiva predice que el coronavirus SARS-CoV-2 está sometido a mutaciones continuas que producen una deriva genética que acabará conduciendo a su separación en diferentes cepas en el futuro. Lo habitual es que las cepas que mejor se adapten al ser humano (es decir, las que tengan una letalidad reducida y produzcan síntomas más leves) sean las que se acaben propagando con mayor facilidad. Pues al coronavirus le «interesa» sobrevivir el máximo tiempo posible entre los humanos y que no le pase lo que pasó con el SARS-CoV (cuya epidemia fue contenido y desapareció de la circulación entre los humanos).
Para sobrevivir, los virus RNA deben de encontrar un equilibrio entre  

a) la capacidad de adaptación al huésped y
b) la capacidad de replicarse aceptablemente bien. 

Dicho de otra manera:  Las pòlimerasas de RNA son malas  , tienen una  proof reading MUY BAJA , lo que da lugar a que su  capacidad replicativa sea baja, mientras que las polimerasas de DNA  son más  seguras, y comenten menos errores.


Esto se traduce en que los virus RNA  tienen más facil su ADAPTABILIDAD porque están contínuamente mutando, pero tienen igualemente  mayor propension a cometer  "mutagénesis  fatales" ó errores que acaben con su "vida" ( suponiendo que los virus sean estructuras vivas) , primos hermanos de los priones, lo cual ya es mucho suponer.

The polymerase of RNA viruses lacks the proofreading capacity found in the polymerase of DNA viruses, leading to high error rates and low replicative fidelity. 

Although the high mutation rate of RNA viruses enables them to readily adapt to environmental changes, they also risk 'lethal mutagenesis' when accumulating mutations corrupt essential functions. 

Here, Smith et al. reveal that, in the case of severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV), an exoribonuclease domain (ExoN) in non-structural protein 14 provides proofreading activity that protects the virus from mutagenesis.

Previous work in coronaviruses, the largest RNA viruses, had shown that ExoN deletion leads to reduced replicative fidelity and attenuation of virulence

El concepto  "proof reading"  es relativamente bajo en los Nidovirus y coronavirus.  Los coronavirus  son capaces de desarrollar 16 proteínas estructurales ( llamadas nsp 1 a 16). 


En el famoso vídeo sobre el  supuesto origen  artero y perverso del virus, aparece una similitud del 100 % en algunas de éstas nsp. En concreto la nsp 7 y la proteína  E,  Esto fue  comentado por la "experta" Judy A. Mikovits  que previamente en 2011 fue demandada y arrestada por  simulación y falsificación de datos. 

En dicho documental ella indica que  " no había murciélagos en el mercado de Wuhan" y que  " al menos 45 de los primeros enfermos no tenía nada que ver con el mercado de Sea food de Wuhan. 

Igualmente indican en sus teoría conspirativa que  hay un 88 % de indentico genoma entre   el  coronavirus del murciélago  bat-SL-CoVZC45  encontrado en 2018 en Zoughshan, un 79 % con el primer SARS-CoV-1 del 2003 y un  50 % con el MERS de  la epidemia de Arabia Saudita del 2012.

Entre los diversos Coronavirus  hay uno de la  hepatitis murina  (MHV) and SARS-CoV, codifica  una actividad  3'-5' exoribonucleasa activity (ExoN) en la nsp 14.Esa nsp 14 es fundamental  para la fidelidad en la replicación.  

La frase básica de los autores del estudio.


 Elucidation of the mechanisms of nsp14-mediated proofreading will have major implications for our understanding of the evolution of RNA viruses, and also will provide a robust model to investigate the balance between fidelity, diversity and pathogenesis. 

Otro estudio , publicado en Nature,  indica que. 

The polymerase of RNA viruses lacks the proofreading capacity found in the polymerase of DNA viruses, leading to high error rates and low replicative fidelity. 

Although the high mutation rate of RNA viruses enables them to readily adapt to environmental changes, they also risk 'lethal mutagenesis' when accumulating mutations corrupt essential functions. 

Here, Smith et al. reveal that, in the case of severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV), an exoribonuclease domain (ExoN) in non-structural protein 14 provides proofreading activity that protects the virus from mutagenesis.

Previous work in coronaviruses, the largest RNA viruses, had shown that ExoN deletion leads to reduced replicative fidelity and attenuation of virulence



Thus, Smith et al. speculated that ExoN is a proofreading enzyme. To test this hypothesis, they infected cells with wild-type (ExoN+) or ExoN-deleted (ExoN) SARS-CoV in the presence of the mutagenic pyrimidine analogue 5-fluorouracil (5-FU). Indeed, loss of ExoN sensitized the virus to 5-FU, as shown by a 160-fold reduction in viral replication for ExoN SARS-CoV compared with ExoN+ SARS-CoV. 

Furthermore, genome sequencing of viral populations after 5-FU treatment revealed that ExoN SARS-CoV harboured 3,648 mutations, whereas ExoN+ SARS-CoV accumulated only 259 mutations. 

 ExoN proofreading protects SARS-CoV from the deleterious effects of mutagens, such as 5-FU.

However, because ribavirin is a mutagenic nucleoside analogue, it might have similar effects to 5-FU in the absence of ExoN. Consistent with this, ExoN murine CoV was more sensitive to ribavirin than ExoN+ murine CoV, although further experiments indicated that other mechanisms besides mutagenesis (for example, reduced RNA synthesis) contributed to this ExoN-dependent effect. As the cells used for SARS-CoV infections failed to take up ribavirin, the sensitivity of ExoN SARS-CoV to ribavirin remains unclear.
Nevertheless, coronavirus ExoN is the first proofreading protein reported in an RNA virus, and targeting ExoN is a promising strategy to develop new coronavirus inhibitors and sensitizers to existing antivirals.


Desde 2013 , se han publicado en Gen Bank 46 genomas completos de  Ortocoronavirus.


 Genoma del COVID19, descrito por vez primera en Como pueden ver  hay dos  subunidades en la spike proteín, la S1 y la s2. La S1  se encarga del ANCLAJE y la S2 de la FUSION. Previamente se produce un "cleavage" o lisis  tras  el  anclaje de la  proteína S al receptor    humano de la ACE/2.  Se forma un epítope  y aparece una proteása dependiente de serina que interviene en  ése proceso de fusiñónb, llamada furina.

 RBD: region binding  dominion; está incluido en  el genoma en S1.
 RBM está en ROJO en S1 tanmbién.


Para confirmar estas conclusiones estructurales se han realizado estudios bioquímicos para la afinidad de la unión RBD/hACE2 tras introducir ciertas mutaciones en SARS-CoV-2 RBD. Dicen los genetistas entendidos  o  sugieren que el coronavirus de murciélagos RaTG13 podría infectar a los humanos (lo que ratifica el origen zoonótico de la epidemia). Además, las RBMs de SARS-CoV-2 y bat-COV RaTG13 contienen un motivo similar de cuatro residuos en la cresta de unión a ACE2, lo que apoya que uno ha evolucionado a partir del otro





Figura 1.  lA PRIMERA Secuenciación de un virus extraño  aislado el 26 de Diciembre, que se  consigue la secuenciación el día 10 de Enero. Sporpendentemente, el partido Comunista Chino decide compartir el genoma con la Comunidad Internacional: Tiene 30,000 kilo bases de  RNA monocatenario, (+) o que se  replica a en el mismo sentido que las manecillas del reloj. Es el primer genoma conocido de un  virus poco conocido hasta ahora, pese a que los beta coronavirus se conocian ya desde 1978.




Instrucciones del ARN para hacer la proteína ORF1b
Proteína ORF1d
ína espiga
E
M
N
Inicio del genoma del coronavirus
30.000 ‘letras’ de ARN

Un nuevo coronavirus 26 de diciembre

En diciembre apareció un grupo de casos de una neumonía misteriosa alrededor de un mercado de mariscos en Wuhan, China. A inicios de enero, los investigadores secuenciaron el primer genoma de un nuevo coronavirus, que aislaron en un hombre que trabajaba en el mercado. Ese primer genoma se convirtió en la referencia para que los científicos rastreen el virus SARS-CoV-2 mientras se propaga por el mundo.

Genoma Wuhan-Hu-1, tomado el 26 de diciembre de uno de los primeros pacientes en Wuhan

Un error tipográfico en el ARN 8 de enero

Una célula infectada por un coronavirus libera millones de nuevos virus, todos con copias del genoma original. A medida que la célula copia ese genoma, a veces comete errores, que generalmente consisten en una sola letra equivocada. Estos errores tipográficos son llamados mutaciones. Mientras los coronavirus se propagan de persona a persona, acumulan más mutaciones al azar.
El genoma a continuación viene de otro de los primeros pacientes de Wuhan y era idéntico al primer caso, excepto por una mutación. La letra 186 del ARN era u en lugar de c.

Genoma WH-09, tomado el 8 de enero de otro paciente en Wuhan
u
◀ Cambió la letra 186 del ARN
Cuando los investigadores compararon varios genomas del grupo de casos de Wuhan encontraron solo unas pocas mutaciones nuevas, lo que sugiere que los diferentes genomas descendieron de un ancestro común reciente. Los virus acumulan nuevas mutaciones a un ritmo más o menos regular, por lo que los científicos pudieron calcular que el origen del brote fue en China, en algún momento de noviembre de 2019.

Un descendiente, dos mutaciones más 27 de febrero

Fuera de Wuhan, la misma mutación en la letra 186 del ARN se encontró en solo otra muestra, que se recolectó siete semanas después a 965 kilómetros al sur, en Guangzhou, China. La muestra de Guangzhou podría ser descendiente directa de la primera muestra de Wuhan. O podrían ser primos virales que comparten un ancestro común.
Durante esas siete semanas, el linaje de Guangzhou saltó de persona a persona y pasó por varias generaciones de nuevos virus. Y en el camino, desarrolló dos nuevas mutaciones: dos letras más del ARN cambiaron a u.

Genoma GZMU0030, tomado el 27 de febrero en Guangzhou
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u
◀ Otra letra del ARN mutó
◀ Esta mutación también cambió un aminoácido
I
zhou

¿Cuándo importan las mutaciones?

Las mutaciones a menudo cambiarán un gen sin cambiar la proteína que codifica.
Las proteínas son largas cadenas de aminoácidos plegadas en diferentes formas. Cada aminoácido está codificado por tres letras genéticas, pero, en muchos casos, una mutación a la tercera letra de un trío seguirá codificando el mismo aminoácido. Estas “mutaciones silenciosas” no cambian la proteína resultante.
Las mutaciones “no silenciosas” sí cambian la secuencia de una proteína, y la muestra del coronavirus de Guangzhou obtuvo dos mutaciones no silenciosas.

Proteína ORF1a
Proteína E
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u
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◀ Un aminoácido cambió en la proteína ORF1a
Un aminoácido cambió en la proteína E ▶
I
Y
Pero las proteínas pueden estar formadas por cientos o miles de aminoácidos. Cambiar un solo aminoácido a menudo no tiene un efecto notable en su forma o en en su funcionamiento.

Algunas mutaciones desaparecen; otras se propagan

Con el paso de los meses, parte del genoma del coronavirus ha ganado muchas mutaciones. Otra ha ganado pocas, o ninguna. Esta sorprendente variación puede contener pistas importantes sobre la biología del coronavirus.
Las partes del genoma que han acumulado muchas mutaciones son más flexibles. Pueden tolerar cambios en su secuencia genética sin causar daño al virus. Las partes con pocas mutaciones son más frágiles. Las mutaciones en esas partes pueden destruir el coronavirus al causar cambios catastróficos en sus proteínas. Esas regiones esenciales pueden ser objetivos especialmente adecuados para atacarlo con medicamentos antivirales.

Número total de sustituciones de aminoácidos encontradas en 4400 genomas de coronavirus
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Las líneas más largas muestran sitios donde el genoma es más tolerante a las mutaciones
Las brechas pueden señalar puntos críticos en el genoma que no pueden tolerar mutaciones
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Las mutaciones que se van acumulando en los genomas del coronavirus permiten a los científicos rastrear la propagación de la COVID-19 alrededor del mundo.

El primer caso estadounidense 15 de enero

El 15 de enero, un hombre , de 35 baños que venía de una estancia en Wuhan empezó a sentierse mal y fué  el primer caso en EEUU .
El genoma de su virus contenía tres mutaciones de una sola letra, también encontrada en el virus en China. Esas mutaciones permitieron a los científicos rastrear la infección del hombre hasta su origen.

Genoma WA1, tomado el 19 de enero de un hombre en el área de Seattle que visitó Wuhan
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Genomas idénticos tomados el 21 de enero en las provincias de Fujian Guangdong
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Wuhan
Fujian
Guangdong

La epidemia oculta de Seattle 24 de febrero

Cinco semanas después, un estudiante de la escuela secundaria  del condado de Snohomish County, Washington, desarrolló síntomas similares de tos, malestar y dolor de garganta.Se  encontró que compartía las mismas mutaciones distintivas encontradas en el primer caso en Washington, pero que también tenía tres mutaciones adicionales.

Genoma WA2, tomado el 24 de febrero de un estudiante de secundaria en el área de Seattle
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Esta combinación de  mutaciones  viejas y recientes sugerían que el estudiante no se había contagiado de alguien que había llegado recientemente de otro país. En cambio, el coronavirus probablemente estuvo circulando en el área de Seattle durante aproximadamente cinco semanas, desde mediados de enero.
A partir de entonces, los virus con un vínculo genético al grupo de Washington han en mas de diez estados y varios países, así como en el Crucero sometido a la cuarentena, el Prncess.

Genoma tomado el 5 de marzo de dos pasajeros del crucero Grand Princess
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Transmisión temprana en California 26 de febrero

Otro coronavirus también circulaba silenciosamente indetectado  en California. El 26 de febrero el organisnmo de salud Pública de Atlanta anunció que un paciente  de Solano County  había dado positivo,   sin vínculos conocidos con ningún caso anterior ni viajes al extranjero.

Una muestra tomada al día siguiente reveló que el virus no tenía las mutaciones distintivas encontradas en el estado de Washington. En cambio, tenía una única mutación que lo distinguía del genoma original de Wuhan. Eso indica que llegó a California de China a través de una introducción separada.

Genoma UC4, tomado el 27 de febrero de un paciente que vivía en el condado de Solano, California
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Dos trabajadores de la salud que habían cuidado  al paciente también se enfermaron. Junto con la mutación del paciente, sus muestras tenían mutaciones adicionales.

Genoma UC2, tomado el 27 de febrero de un trabajador de la salud que cuidó del paciente
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Casos por doquier

En enero y febrero, más personas llegaron a Estados Unidos con  virus  que portaban mutaciones que indicaban que habían llegado de China u otras partes de Asia. Pero en Nueva York, la mayoría de virus que los investigadores aislaron tenían coincidencias genéticas con los  los virus que venían de Europa.

De Shanghái a Múnich 19 de enero

El 19 de enero — el mismo día que el primer paciente de Washington dio positivo para el coronavirus— una mujer de Shanghái aterrizó en Múnich. No mucho antes de su viaje, sus padres, de Wuhan, la habían visitado. Cuando llegó a Múnich solo sintió síntomas leves, que  atribuyó al jet lag.
La mujer era empleada de una empresa alemana. El día después de llegar a Múnich, asistió a una reunión de la compañía. Varios otros empleados que estuvieron en la reunión se enfermaron de COVID-19. El genoma del coronavirus de un alemán que participó en la reunión tenía mutaciones que lo vinculaban a China.

Genoma BavPat1, tomado el 28 de enero de un hombre de negocios alemán en el área de Múnich
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GVersiones genéticamente similares del virus se propagaron más tarde por otras partes de Europa, pero no queda claro si procedían de este conjunto de casos o de alguna importación distinta.

 Nueva York 1 de marzo

El primer caso confirmado de COVID-19 en Nueva York fue anunciado el 1 de marzo, después de que una mujer que vivía en Manhattan se infectó al visitar Irán. De todos los virus que los científicos han estudiado desde entonces en Nueva York, ninguno tiene las mutaciones en el genoma de su coronavirus. Eso indica que su infección no formaba parte de una cadena continua de transmisiones.

Genoma NY1-PV08001, tomado el 29 de febrero de una mujer en Nueva York que viajó a Irán
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En cambio, la mayoría de los coronavirus de Nueva York que los científicos han secuenciado variados  tipos de genomas de Asia, Europa  y otras  partes de Estados Unido.
Reintroducciones y deportaciones Marzo y abri.
Pronto, Estados Unidos y Europa se convirtieron en nuevas fuentes de introducción para otros países. Decenas de guatemaltecos enviados en vuelos de deportación desde Estados Unidos se fueron infectados. 


Genoma BJ2460, una de las tres muestras idénticas tomadas el 14 de marzo en Pekín
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Un genoma casi idéntico se encontró en tres personas en Bélgica, las muestras se tomaron entre el 13 y el 20 de marzo
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Un virus de mutación lenta

En este punto de la pandemia, los genomas de coronavirus con 10 o menos mutaciones son comunes, y solo un pequeño número tiene más de 20 mutaciones, que es todavía menos de una décima parte del porcentaje del genoma.

Genoma VIC995, tomado el 31 de marzo de una mujer en Victoria, Australia
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Con el tiempo, los virus pueden evolucionar a nuevas cepas. En otras palabras: a linajes virales que son significativamente diferentes entre sí. Desde enero, los investigadores han secuenciado muchos miles de genomas de SARS-CoV-2 y rastreado todas las mutaciones que han surgido. Hasta ahora, no han encontrado evidencia convincente de que las mutaciones hayan tenido un cambio significativo en cómo nos afecta el virus.

Número total de sustituciones de aminoácidos encontradas en 4400 genomas de coronavirus
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De hecho, los investigadores han encontrado que el coronavirus está mutando de manera relativamente lenta en comparación con otros virus.

Se calcula  que , cada mes, un linaje de coronavirus puede adquirir solo dos mutaciones de una letra.


En el futuro, el coronavirus puede incorporar algunas mutaciones que lo ayuden a evadir nuestro sistema inmunitario.

 Pero , de momento , la lenta tasa de mutación del coronavirus significa que estos cambios surgirán en el transcurso de los años.



Lo que no sabemos del maldito COVID19

Los investigadores solo han secuenciado una  muy pequeña fracción de los coronavirus que hoy infectan a , sabemos que hay 1,7 millones de otros virus pendiente de ser clasificados taxonómicamente.

No sabemos  que típo de inmunidad genera.
No sabemos la existencia de portadores sanos asintomáticos. 
No sabemos cuando vamos a tener una vacuna.
No sabemos  si el virus variará su proof reading , parece ser que no y que, de momento, no es especialmente  alto su adaptabilidad.



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    Smith, E. C. et al. Coronaviruses lacking exoribonuclease activity are susceptible to lethal mutagenesis: evidence for proofreading and potential therapeutics.
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